Adhesive and invasive capacities of Edwarsiella tarda isolated from South American sea lion

Edwarsiella tarda is a zoonotic bacterium that can be isolated from humans, animals and the environment. Although E. tarda is primarily considered a fish pathogen, it is the only species of its genus considered to be pathogenic for humans as well. A survey of zoonotic intestinal bacteria in fresh feces from South American sea lions (SASL) Otaria flavescens, reported E. tarda as the most frequently isolated species. In this study, we used HEp-2 cells to establish in vitro the adherence and invasive ability of 17 E. tarda strains isolated from SASL fecal material. All the strains were able to adhere and invade HEp-2 cells with adhesion and invasion percentages ranging from 56 to 100% and 21 to 74%, respectively. Despite the expression of these pathogenic factors, further investigation is needed to determine whether this bacterium could play a role as primary pathogen for this and other species of pinnipeds.

HYPOXIC STRESS, HEPATOCYTES AND CACO-2 VIABILITY AND SUSCEPTIBILITY TO Shigella flexneri INVASION / Stress hipóxico, viabilidade e susceptibilidade de hepatócitos e células Caco-2 à invasão por Shigella flexneri

SUMMARY Inflammation due to Shigella flexneri can cause damage to the colonic mucosa and cell death by necrosis and apoptosis. This bacteria can reach the bloodstream in this way, and the liver through portal veins. Hypoxia is a condition present in many human diseases, and it may induce bacterial translocation from intestinal lumen. We studied the ability of S. flexneri to invade rat hepatocytes and Caco-2 cells both in normoxic and hypoxic microenvironments, as well as morphological and physiological alterations in these cells after infection under hypoxia. We used the primary culture of rat hepatocytes as a model of study. We analyzed the following parameters in normoxic and hypoxic conditions: morphology, cell viability, bacterial recovery and lactate dehydrogenase (LDH) released. The results showed that there were fewer bacteria within the Caco-2 cells than in hepatocytes in normoxic and hypoxic conditions. We observed that the higher the multiplicity of infection (MOI) the greater the bacterial recovery in hepatocytes. The hypoxic condition decreased the bacterial recovery in hepatocytes. The cytotoxicity evaluated by LDH released by cells was significantly higher in cells submitted to hypoxia than normoxia. Caco-2 cells in normoxia released 63% more LDH than hepatocytes. LDH increased 164% when hepatocytes were submitted to hypoxia and just 21% when Caco-2 cells were in the same condition. The apoptosis evaluated by Tunel was significantly higher in cells submitted to hypoxia than normoxia. When comparing hypoxic cells, we obtained more apoptotic hepatocytes than apoptotic Caco-2 cells. Concluding our results contribute to a better knowledge of interactions between studied cells and Shigella flexneri. These data may be useful in the future to define strategies to combat this virulent pathogen. .

RESUMO A inflamação causada por Shigella flexneri pode causar danos à mucosa do cólon e morte celular por necrose e apoptose. Esta bactéria pode atingir a corrente sanguínea por esta via e o fígado através da veia porta. A hipóxia é uma condição presente em muitas doenças humanas, podendo induzir a translocação bacteriana a partir do lúmen intestinal. Nós estudamos a capacidade de S. flexneri invadir hepatócitos de rato e células Caco-2 nos microambientes de normóxia e hipóxia, bem como as alterações morfológicas e fisiológicas dessas células após a infecção sob hipóxia. Utilizamos a cultura primária de hepatócitos de ratos como modelo de estudo. Nós analisamos os seguintes parâmetros em condições de normóxia e hipóxia: morfologia, viabilidade celular, recuperação bacteriana e liberação de lactato desidrogenase (LDH). Os resultados mostraram menor quantidade de bactérias dentro das células Caco-2 do que em hepatócitos em condições de normóxia e hipóxia. Nós observamos que quanto maior foi a multiplicidade de infecção (MOI), maior também foi a recuperação bacteriana em hepatócitos. A condição hipóxica foi capaz de diminuir a recuperação de bactérias dos hepatócitos. A citotoxicidade avaliada pela liberação de LDH foi significativamente maior em células submetidas à hipóxia do que normóxia. As células Caco-2 em normóxia produziram 63% mais LDH do que os hepatócitos. O LDH aumentou 164% quando os hepatócitos foram submetidos à hipoxia e apenas 21% quando as células Caco-2 estavam na mesma condição. A apoptose avaliada por TUNEL foi significativamente ...

Tnf-a production and apoptosis in hepatocytes after listeria monocytogenes and salmonella typhimurium invasion / Produção de tnf-a e apoptose em hepatócitos após invasão por listeria monocytogenes e salmonella typhimurium

Invasion of hepatocytes by Listeria monocytogenes (LM) and Salmonella Typhimurium (ST) can stimulate tumor necrosis factor alpha (TNF-α) release and induce apoptosis. In this study, we compared the behavior of hepatocytes invaded by three L. monocytogenes serotypes (LM-4a, LM-4b and LM-1/2a) and by ST to understand which bacterium is more effective in the infectious process. We quantified TNF-α release by ELISA, apoptosis rates by annexin V (early apoptosis) and TUNEL (late apoptosis) techniques. The cell morphology was studied too. TNF-α release rate was highest in ST-invaded hepatocytes. ST and LM-1/2a induced the highest apoptosis production rates evaluated by TUNEL. LM-4b produced the highest apoptosis rate measured by annexin. Invaded hepatocytes presented various morphological alterations. Overall, LM-4b and LM-1/2a proved to be the most efficient at cell invasion, although ST adapted faster to the environment and induced earlier hepatocyte TNF-α release.

A invasão de hepatócitos por Listeria monocytogenes (LM) e Salmonella Typhimurium (ST) pode estimular a liberação do Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e induzir a apoptose celular. Neste estudo comparamos o comportamento de hepatócitos invadidos por três sorotipos de L. monocytogenes (LM-4a, LM-4b e LM-1/2a) e por ST para entender qual bacteria é mais efetiva no processo infeccioso. Nós quantificamos a liberação de TNF-α pelos hepatócitos por ELISA e as taxas de apoptose pelas técnicas de anexina V (apoptose precoce) e TUNEL (apoptose tardia). A morfologia das células foi estudada também. A taxa de liberação de TNF-α foi mais alta em hepatócitos invadidos por ST. ST e LM-1/2a induziram as maiores taxas de apoptose pelo método TUNEL, enquanto LM-4b produziu as maiores taxas de apoptose por anexina V. Os hepatócitos invadidos apresentaram várias alterações morfológicas. Na análise do conjunto de dados, os sorotipos LM-4b e LM-1/2a provaram ser os mais eficientes na invasão celular, enquanto que ST adaptou-se mais rápido ao meio e induziu a liberação precoce de TNF-α pelos hepatócitos.

Rat hepatocyte invasion by Listeria monocytogenes and analysis of TNF-alpha role in apoptosis

Listeria monocytogenes, agente etiológico de infecção grave de origem alimentar, utiliza mecanismos sofisticados de entrada no citoplasma do hospedeiro e manipulação do citoesqueleto, resultando em morte celular. As interações entre células do hospedeiro e bactérias podem resultar em produção de citocinas como o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-a). Hepatócitos têm potencial de produzir citocinas pro-inflamatórias como TNF-a, quando invadidos por bactérias. No presente trabalho demonstramos o comportamento dos hepatócitos invadidos por L. monocytogenes pela análise microscópica, determinação da produção de TNF-a por bioensaio e análise da apoptose pela técnica TUNEL. A presença da bactéria, na razão que variou de 5 a 50.000 bactérias por célula, induziu ruptura das monocamadas celulares. Observamos presença de bactérias internalizadas na 1ª hora de incubação por microscopia eletrônica. Os níveis de TNF-a aumentaram da 1ª hora de incubação até a 6ª hora, variando de 0 a 3749 pg/mL. Nas 7ª e 8ª horas de incubação, ocorreram quedas não significativas dos níveis de TNF-a, indicando possível saturação dos receptores celulares. A quantidade de TNF-a produzido por hepatócitos foi dependente do tempo de incubação, assim como da proporção entre bactérias e células. A taxa de apoptose aumentou diretamente com o tempo de incubação (1 h a 8 + 24 h), variando de 0 a 43%, assim como com a razão bactérias : células. Estes resultados mostram a habilidade de L. monocytogenes não-hemolítica em invadir os hepatócitos, e as principais conseqüências deste fenômeno são: liberação de TNF-a e indução de apoptose. Assim, podemos especular que hepatócitos usam apoptose induzida por TNF-a para liberar bactérias de seu interior, facilitando a destruição destas pelo sistema imune.